.bio | Gibson Assembly 技术组装 DNA

本文仅介绍已公开的生物工程技术的原理，不涉及具体的实验操作步骤。进行生物实验之前，须完成和实验室生物安全等级匹配的培训。

作为一种黑箱

Gibson Assembly 可以一次实验组装多段已有的 DNA。

对于常用且简单的，把 2 段 DNA 分子组合成环形 DNA（通常是质粒）的情况：

输入

• 双链 DNA 片段 A 5'--> A -->3'
• 双链 DNA 片段 B 5'--> B -->3'

参数

• A 的正向引物：（B序列的末尾若干碱基 + A序列的开头若干碱基）
• A 的反向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）的反向互补序列
• B 的正向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）
• B 的反向引物：（B序列的末尾若干碱基 + A序列的开头若干碱基）的反向互补序列

输出

• 环形双链 DNA

5'--> A -->3'
|          |
3'<-- B <--5'

黑箱之内

预备知识

DNA 大分子的单体是脱氧核苷酸。脱氧核苷酸分子由磷酸基、脱氧核糖、碱基通过共价键连接形成，磷酸基连接在本分子的脱氧核糖的 5’ 号碳原子上。

单链 DNA 分子由脱氧核苷酸分子脱水缩合形成，后一个脱氧核苷酸的磷酸基团连接到前一个的脱氧核糖的 3’ 号碳原子上。单链是有方向的，习惯上定义为从 5’ 指向 3’ 端。

两条碱基序列足够匹配的单链 DNA 分子，配对的碱基之间通过氢键连接，形成双链 DNA 分子。双链分子中的两条单链的方向相反。

描述一段双链 DNA 的序列时，约定俗成选一条链作为主链，然后从 5' 到 3' 端读出它的序列。

比如当我们说一段双链 DNA 的序列是 AGCTGCTCTT 时，指的实际上是这样一个分子：

5'-A-G-C-T-G-C-T-C-T-T-3'
   | | | | | | | | | |
3'-T-C-G-A-C-G-A-G-A-A-5'

把下面那条单链的序列从右往左读 AAGAGCAGCT 叫做原序列的反向互补 (reverse complement)（对它本身来说也是从 5’ 到 3’ 读。）

PCR 构造重合区间

Gibson assembly 的开头通常是一种特殊的 PCR，通过设计引物 (primer)，给 A 和 B 分子的两端分别加上对方的一点序列：

文章开始时说的输入和参数如下：

PCR 的第一个循环：

第一个循环的结果是两种带有悬空核苷酸的双链 DNA：

PCR 的第二个循环中，最符合我们需要的情况：

结果：

PCR 的第三个循环：

开始出现我们的最终产物：

ChatGPT 说，设计引物的熔融温度时，应只根据和最初模板配对的部分计算，不考虑在最初循环时悬空在外的那半截。

组装过程

有了重合序列之后，以下各步一个试管一次反应就可完成：

1. 外切酶从两个序列的 5’ 端开始降解若干核苷酸；
2. 两序列退火，重合区的碱基互补配对
3. DNA 聚合酶补上第 1 步多切掉的核苷酸
4. DNA 连接酶补上最后一个 3’,5’-磷酸二酯键。