Gibson Assembly 可以一次实验组装多段 DNA 分子。

Gibson Assembly 可以一次实验组装多段 DNA 分子。

DNA 大分子的单体是脱氧核苷酸。脱氧核苷酸分子由碱基、脱氧核糖、磷酸基构成。碱基的种类 (A/G/C/T) 携带信息，连接到脱氧核糖的 1’ 号碳原子；磷酸基连接到脱氧核糖的 5’ 号碳原子。

脱氧核苷酸分子首尾相接，脱水缩合形成单链 DNA 分子。后一个脱氧核苷酸和磷酸基连接到前一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的 3’ 号碳原子。因此，DNA 单链具有方向性：一端暴露的是脱氧核糖的 5’ 号碳原子，称为 5’ 端；另一端暴露的是脱氧核糖的 3’ 号碳原子，称为 3’ 端。习惯上把 5’ 端称为 DNA 单链的头，把 3’ 端称为尾。

2 条单链 DNA 反向互补配对形成双链 DNA 分子。“反向”指的是如果以其中一条链的 5’ 端作为双链 DNA 分子的开头，另一条单链沿这个方向是从 3’ 端到 5’ 端；“互补配对”指的是特定种类的碱基对 (A-T, C-G) 之间通过氢键结合。

当我们说一段双链 DNA 的序列是 AGCTGCTCTT 时，指的实际上是这样一个分子：

5'-A-G-C-T-G-C-T-C-T-T-3'    编码链
   | | | | | | | | | |
3'-T-C-G-A-C-G-A-G-A-A-5'    模板链

把下面那条单链的序列从右往左读 AAGAGCAGCT 叫做原序列的反向互补 (reverse complement)（对这条单链本身来说也是从 5’ 到 3’ 读。）

作为一种黑箱

Gibson Assembly 是一种化学反应，可以将两段或以上的双链 DNA 分子按指定的顺序首尾相接。

输入

每个连接接口都对应两段相邻的 DNA 片段，例如：

5'--> A -->3'        5'--> B -->3'

参数

知道了各段 DNA 分子的序列信息，每个接口附近的 DNA 序列可以确定 2 个 PCR 引物 (primers)：

  • A 的反向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）的反向互补序列
  • B 的正向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）

输出

先分别用每一段 DNA 为模板、各自的正反向引物做 PCR；

然后把各个 PCR 产物混合在一起，加入 Gibson 试剂反应，得到链接起来的长链：

举例：2 段线形 DNA 分子组合成环形 DNA

2 段线形 DNA 分子

  • 5'--> A -->3'
  • 5'--> B -->3'

接成一个环时，一共有两个接口需要连接：

  1. [A 序列的 3’ 端] - [B 序列的 5’ 端]
  2. [B 序列的 3’ 端] - [A 序列的 5’ 端]

两个接口

  • A 的正向引物：（B序列的末尾若干碱基 + A序列的开头若干碱基）
  • A 的反向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）的反向互补序列
  • B 的正向引物：（A序列的末尾若干碱基 + B序列的开头若干碱基）
  • B 的反向引物：（B序列的末尾若干碱基 + A序列的开头若干碱基）的反向互补序列

以 A 为，Gibson Assembly 可以生成环形双链 DNA：

5'--> A -->3'
|          |
3'<-- B <--5'

黑箱之内

PCR 构造重合区间

Gibson assembly 的第一步通常是一种特殊的 PCR，通过设计具有悬空段 (overhanging) 和互补段 (binding) 的引物 (primer)，给 A 和 B 分子的两端分别加上对方的一点序列：

文章开始时说的输入和参数如下：

PCR 的第一个循环：

第一个循环的结果是两种带有悬空核苷酸的双链 DNA：

PCR 的第二个循环中，最符合我们需要的情况：

结果：

PCR 的第三个循环：

开始出现我们的最终产物：

设计引物的熔融温度时，应只根据和最初模板配对的部分计算，不考虑在最初循环时悬空在外的那半截。

组装过程

有了重合序列之后，以下各步一个试管一次反应就可完成：

  1. 外切酶从两个序列的 5’ 端开始降解若干核苷酸；
  2. 两序列退火，重合区的碱基互补配对
  3. DNA 聚合酶补上第 1 步多切掉的核苷酸
  4. DNA 连接酶补上最后一个 3’,5’-磷酸二酯键。

本文收录于以下合集：